IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) аналоги субстрати β-галактозидаза мебошад, ки хеле индуксияшаванда аст. Дар зери индуксияи IPTG, индуктор метавонад бо сафедаи репрессор комплекс ташкил кунад, то конформатсияи сафедаи репрессор тағйир ёбад, то ки онро бо гени мақсаднок якҷоя кардан мумкин набошад ва гени мақсаднок самаранок ифода карда шавад. Пас, консентратсияи IPTG бояд ҳангоми таҷриба чӣ гуна муайян карда шавад? Ҳар қадар калонтар бошад, ҳамон қадар беҳтар аст?
Аввалан, биёед принсипи индуксияи IPTG-ро фаҳмем: лактозаи оперони (унсури) E. coli се гени сохторӣ, Z, Y ва A дорад, ки мутаносибан β-галактозидаза, пермеаза ва ацетилтрансферазаро рамзгузорӣ мекунанд. lacZ лактозаро ба глюкоза ва галактоза ё ба алло-лактоза гидролиз мекунад; lacY ба лактоза дар муҳити атроф имкон медиҳад, ки аз мембранаи ҳуҷайра гузарад ва ба ҳуҷайра ворид шавад; lacA гурӯҳи ацетилро аз ацетил-CoA ба β-галактозид интиқол медиҳад, ки ин бартараф кардани таъсири токсикиро дар бар мегирад. Илова бар ин, пайдарпайии амалиётӣ O, пайдарпайии ибтидоӣ P ва гени танзимкунанда I мавҷуданд. Коди гени I як сафедаи репрессор аст, ки метавонад ба мавқеи O-и пайдарпайии оператор пайваст шавад, то оперон (мета) репрессия ва хомӯш карда шавад. Инчунин як макони пайвастшавӣ барои макони пайвастшавии сафедаи фаъолкунандаи гени катаболикӣ-CAP дар болооби пайдарпайии ибтидоии P мавҷуд аст. Пайдарпайии P, пайдарпайии O ва макони пайвастшавии CAP якҷоя минтақаи танзимкунандаи lac оперонро ташкил медиҳанд. Генҳои рамзгузории се фермент аз ҷониби як минтақаи танзимкунанда барои ноил шудан ба ифодаи ҳамоҳангшудаи маҳсулоти ген танзим карда мешаванд.
Дар сурати набудани лактоза, лактоза (мета) дар ҳолати репрессия қарор дорад. Дар ин вақт, репрессори лак, ки бо пайдарпаии I таҳти назорати пайдарпаии промоутери PI ифода ёфтааст, ба пайдарпаии O пайваст мешавад, ки аз пайвастшавии полимеразаи РНК ба пайдарпаии P пешгирӣ мекунад ва оғози транскрипсияро бозмедорад; вақте ки лактоза мавҷуд аст, лактоза (мета) метавонад индуксия карда шавад. Дар ин системаи оперон (мета), индуктори воқеӣ худи лактоза нест. Лактоза ба ҳуҷайра ворид мешавад ва аз ҷониби β-галактозидаза катализ карда мешавад, то ба аллолактоза табдил ёбад. Дуюмӣ, ҳамчун молекулаи индуктор, ба сафедаи репрессор пайваст мешавад ва конформатсияи сафедаро тағйир медиҳад, ки боиси ҷудошавии сафедаи репрессор аз пайдарпаии O ва транскрипсия мегардад. Изопропилтиогалактозид (IPTG) ҳамон таъсирро ба аллолактоза дорад. Он як индуктори хеле пурқувват аст, ки аз ҷониби бактерияҳо мубодила намешавад ва хеле устувор аст, аз ин рӯ он дар лабораторияҳо васеъ истифода мешавад.
Чӣ тавр консентратсияи оптималии IPTG-ро муайян кардан мумкин аст? Масалан, E. coli-ро гиред.
Штамми аз ҷиҳати генетикӣ тағйирёфтаи E. coli BL21, ки дорои pGEX рекомбинантии мусбати мусбат (CGRP/msCT) буд, ба муҳити моеъи LB, ки дорои 50μg·mL-1 Ампер буд, ворид карда шуд ва шабона дар ҳарорати 37°C парвариш карда шуд. Культураи дар боло зикршуда барои парвариши васеъ ба 10 шишаи муҳити моеъи LB, ки дорои 50μg·mL-1 Ампер буд, бо таносуби 1:100 ворид карда шуд ва вақте ки арзиши OD600 0.6~0.8 буд, IPTG ба консентратсияи ниҳоӣ илова карда шуд. Он 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 аст. Пас аз индуксия дар ҳамон ҳарорат ва дар ҳамон вақт, аз он 1 мл маҳлули бактериявӣ гирифта шуд ва ҳуҷайраҳои бактериявӣ бо роҳи сентрифугакунӣ ҷамъоварӣ карда шуданд ва барои таҳлили таъсири консентратсияҳои гуногуни IPTG ба ифодаи сафеда ба SDS-PAGE дучор карда шуданд ва сипас консентратсияи IPTG бо бузургтарин ифодаи сафеда интихоб карда шуд.
Пас аз таҷрибаҳо маълум мешавад, ки консентратсияи IPTG то ҳадди имкон зиёд нест. Ин аз он сабаб аст, ки IPTG барои бактерияҳо заҳролудии муайяне дорад. Аз ҳад зиёд будани консентратсия инчунин ҳуҷайраро мекушад; ва умуман, мо умедворем, ки ҳар қадар сафедаи ҳалшаванда дар ҳуҷайра бештар ифода шавад, ҳамон қадар беҳтар аст, аммо дар бисёр мавридҳо, вақте ки консентратсияи IPTG хеле баланд аст, миқдори зиёди дохилшавӣ ба вуҷуд меояд. Бадан, аммо миқдори сафедаи ҳалшаванда коҳиш меёбад. Аз ин рӯ, консентратсияи мувофиқтарини IPTG аксар вақт на ҳар қадар калонтар бошад, ҳамон қадар беҳтар аст, балки консентратсияи он пасттар аст.
Ҳадафи индуксия ва парвариши штаммҳои аз ҷиҳати генетикӣ тағйирёфта афзоиши ҳосили сафедаи мақсаднок ва кам кардани хароҷот мебошад. Ифодаи гени мақсаднок на танҳо аз омилҳои худи штамм ва ифодаи плазмида, балки аз дигар шароити беруна, ба монанди консентратсияи индуктор, ҳарорати индуксия ва вақти индуксия низ таъсир мегирад. Аз ин рӯ, умуман, пеш аз ифода ва тоза кардани сафедаи номаълум, беҳтар аст, ки вақти индуксия, ҳарорат ва консентратсияи IPTG-ро омӯзед, то шароити мувофиқро интихоб кунед ва натиҷаҳои беҳтарини таҷрибавӣ ба даст оред.
Вақти нашр: 31 декабри соли 2021